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专家讲坛 | 袁超(第6期):离子抑制

日期:2021-05-27

编者导语

很是幸运约请到袁超博士做客“临床质谱网媒体平台”。我们在“专家讲坛”栏目中一连宣布袁先生有关临床质谱的应用、标准品、线性、权重、同位素内标、离子抑制、基质效应等精彩干货内容,以飨读者。承接上期,本期袁先生为各人带来离子抑制的精彩解读。

作者简介

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袁超博士

现任美国华人临床化学学会主席,美国大型临床检测实验室质谱实验室主任。于四川大学获得生物化学学士学位、美国堪萨斯大学获得生物化学博士学位,厥后在霍普金斯和伊利诺伊大学做博士后,主要研究偏向为卵白质组和质谱。袁超博士最近十年主要从事临床质谱要领开发和应用。

第八节 离子抑制

要想明确质谱里的基质效应,必需先相识离子抑制。这两个看法有很大的关联性,但绝对不是统一回事。就似乎收入和利润的关系,都跟挣钱有关,但差别照旧相当显著的。

同样量的内标加在差别的样品里,最后出来的内标的品貌不尽相同,这内里有许多缘故原由。隐藏在其中的一个缘故原由就是离子抑制。要想明确离子抑制,咱们先得把其它的缘故原由去除掉。

第一个缘故原由就是LCMS自己的变数。即即是统一个样品,好比一个标准品,测几遍,每遍的效果都不会完全相同。那统一个样品测n遍,怎样的CV才算可以接受呢?这个没有统一的划定,虽然越小越好。有些检测项目的最大允许误差(total allowable error,简称TEa)是宣布了的,一样平常在20% 到30%之间。以是统一个样品由差别的人在差别的日子里测n遍,一样平常小于20%的CV是可以接受的。但这个20%包括了人与人,天与天之间的差别。一连测统一个样品的CV要远远小于20%才行。我自己的标准是3-6%。3%是优异,6%是及格。这就似乎我总共有20块钱来吃午饭,我可以拿出来3到6块花在盘费上,剩下的钱用来买饭。要是花了15块盘费,这午餐就很主要了,很容易超支。这样的要领就不要往下做了,需要反炉重新优化。

这个3-6%是指浓度,或者被测物和内标的比值的CV。若是只算内标峰面积的CV,我小我私家以为应该在6-10%之间,6%是优异,10%是及格。凭证是什么呢?没有非?蒲У钠局,自己的履历得来的。若是非要找凭证,那就是sigma了。20%除以6%是三,20%除以3%是六 ;三个sigma是及格,六个sigma是优异。sigma的算法和意义以后再讨论。内标的CV一样平常会比【被测物和内标的比值】的CV大一些,翻个一番,到6%~10%的规模,是正常的。这也是我们为什么用内标的初志,就是用来消减被测物信号的CV。

统一个样品测n遍,内标的CV在10%以内 ;那同样的量的内标放在差别的病人样品里,怎样的CV算合适呢?没有统一的标准,你小我私家以为把10%再翻一番,20%。这个值照旧越小越好。能做到10%以内就算好要领了,这样的要领上了临床以后贫困也会少。需要注重一点的是要让仪器预热好了再测,要不然的话,内标转变过大有可能是仪器还没有稳固造成的。尿液里的因素转变太大,很难抵达小于20%的要求,可以放宽一些,甚至到50%。这样做是合适的,由于尿里的浓度已经跟血液浓度没有严酷的相关性了,定性大于定量,除非是24小时尿。若是对尿液浓度的丈量真的要求很高,那最好照旧把CV做到20%以内。若是被测物浓度够高或者质谱仪够迅速,那么一个简朴的步伐就是稀释。任何的样品,不管是血样照旧尿样,稀释100倍以后,一定没有离子抑制了,内标的CV也会很稳固。

把内标的CV只管做的小的利益是什么呢?那就是能更好得看到其它的工具。打一个例如,坐在摇晃的车里写字,车摇晃的厉害了,写的什么字就看不出来了。要想看清写的字,就要把车的摇晃度给降下来。车开得越稳固,越能写更小的字。内标的CV就像车的摇晃度,越小才华望见手的细微行动。

CV降下来以后我们要看什么呢?看outlier,看内标太高或太低的点。若是绝大部分病人的内标都在平均值的上下10%以内,那突然有一个点在20%,那这个点就是outlier。若是内标的CV在40%,那只有60%以外的点才华算outlier,就似乎坐在走山路的车里,波动得太厉害,只能写大字了,只能看到很离谱的outlier了。

某个病人样品里的内标太高或太低,成了与众差别的outlier,这是个忠言,这内里有许多信息,有许多缘故原由。内标太高或太低时,测得的病人效果有可能是禁绝的。直接把这样的效果送出去是可能会对临床爆发负面影响的。内标outlier的成因可以大致分为两类,一类是不可重复的,另一类是可重复的。不可重复的有许多缘故原由。第一,内标加的体积差池,少了或多了。气泡会导致少,tip外面多挂一滴会导致高。不小心加了两次内标也会导致高。第二,样品的体积差池。加少了会导致内标高,加多了会导致内标少。第三,进样量差池。加样时要是混进了个大气泡,会导致内标镌汰。这个有时可以从液相的压力曲线上看的出来。第四,液相什么地方漏了,样品有丧失。一样平常这种情形下,后面的所有的样品的内标都低。以上这几种情形都是不可重复的。一个要领既然已经上临床了,那体现一定是不错的,在大部分的情形下,是不应该泛起上述的情形的。若是真的泛起了,那重复一次还会同样爆发的几率是小之又小。若是真是体积加错了,是能检测出来的,有时肉眼都能看得出。若是再测一次,内标是好的,病人效果跟第一次一样,那就有可能是LC进样时有了气泡或者那里漏了。若是第二次的效果跟第一次纷歧样,那就再测一次,看能不可重复第二次的效果。若是可以,那就说明第一次有可能是体积加错了。总之,这几种缘故原由导致的内标升高或降低是不可重复的,再做一次可能就正常了。

若是再做一次,甚至再做两三次,内标总是偏高或偏低呢?这就是样品自己引起的了,是可以重复的。这内里又分为两个缘故原由,一个是离子抑制,也就是本节的主题,另外一个是滋扰物。离子抑制也是由滋扰物引起的,但这个滋扰物是看不见的,峰的形状没有异常,只是峰面积小了。能看得见的"滋扰物"是会把峰型给搞糟的,多了个峰肩或有拖尾?吹募淖倘盼镆院笤偎,这里只讲看不见的滋扰物,也就是离子抑制。在这种情形下,病人的血液里有一种物质,可以把内标的信号给抑制掉,这就是离子抑制。

离子抑制一样平常爆发在离子化这一步。离子化是链接色谱和质谱的要害办法。离子化着实是和气化险些同时爆发的。这个历程就像一只水枪包括在一个通了电的吹风机里。被检测物和内标从水枪里出来,周围夹裹着吹风机里吹出的热气,周围尚有高压电。最后的效果是热气把液体蒸发了,高压电把分子给离子化了。只有这样,赤裸的带电离子才华飞进质谱,被检测到。

若是病人的样品里有这么一种物质,好比是一种药物或药物的代谢物,它正好和被检测物同时从那液相里出来,同时被离子化。若是这种物质的浓度够高,那么它就会和被检测物以及内标去争抢离子。争抢的效果就是被检测物和内标的离子化不完全,爆发的离子少了,信号自然就弱了,就酿成outlier了。并且这个outlier是可以重复的,由于谁人药品保存在样品里,测几多遍都是谁人时间出来,跟被测物抢离子。

离子抑制怎样确阻止呢?样品稀释一下就可以做到。样品稀释以后,一块儿出来的其它物质就被稀释掉了,可是内标加的照旧一样多。仇人少了,内标的浓度没变,争抢离子的战斗就会偏向内标这一方。最后的效果就是内标的峰会升高(但不会高到跟平均值一样的水平,由于仇人只是镌汰了,并没有消逝),可是被测物和内标的比值稳固。也就是测得的效果在思量到稀释的倍数以后是稳固的。若是稀释后是这样的情形,内标向平均值靠拢,并且测得的效果稳固,那内标镌汰的缘故原由就是离子抑制。测抱病人的效果是可以出具的。

在用稀释来解决离子抑制的历程中,有个很有趣的征象,每次都能重复泛起,那就是稀释一倍以后的内标会好一些,但总达不到预期的水平。好比不稀释的话,内标被抑制了50%,那稀释一倍以后应该是被抑制25%。但现实操作中往往是在30%左右,靠近黄金支解的谁人比例,0.618。它离不稀释的内标值的距离近一些,是4 ;离均值远一些,是6。这内里一定有什么纪律在内里,可是我还没有找到令人信服的科学依据。我只能用一个生涯中的例子来或许诠释一下:没有离子抑制的样品清洁,像牛奶 ;有离子抑制的样品脏,像咖啡。把牛奶咖啡混在一起,颜色居中,但更偏向咖啡一些。就似乎把一滴牛奶滴到咖啡里,咖啡照旧咖啡的颜色 ;把一滴咖啡滴到牛奶里,牛奶就会有咖啡色。

在此总结一下本节的内容:

1. 病人样品里的某种物质在离子化时跟被测物竞争,导致信号降低,造成离子抑制。

2. 离子抑制是可重复的,与样品制备无关。

3. 离子抑制是可以用稀释法来消除的。

4. 离子抑制只有在特殊的情形下才有可能会造成定量的误差。

能通过稀释来解决的离子抑制还不叫"基质效应" ;基质效应是稀释解决不了的离子抑制。要害的要害,是用什么溶液做稀释以及用什么溶液来配标准品。这个留到下一节来讲。

 

声明:本文章泉源“临床质谱网”,作者:袁超博士,asiagame生物已获得临床质谱网和袁超博士授权,如需转载,请联系原作者!

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